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U251MG/TMZ+luc人類星形膠質(zhì)瘤耐替莫唑胺細(xì)胞

Human astroglioma resistant temozolomide cells ,U251 MG/TMZ+luc

貨號：YJ-h244（STR（U251MG鑒定））

價格： 3200.0

規(guī)格： 1*10 ⁶

細(xì)胞介紹

該細(xì)胞由U251MG/TMZ細(xì)胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶Luc基因。

細(xì)胞特性

細(xì)胞運輸、保存及注意事項

細(xì)胞培養(yǎng)試劑的配制

1）TMZ藥物的配制及保存

建議將TMZ藥物配制成16mg/mL的母液：即使用1mL DMSO溶液溶解16mg TMZ藥物，使其完全溶解。（若所購買的TMZ藥物規(guī)格為10mg，則加入625uL DMSO溶液，待其完全溶解即為16mg/mL母液）

注意：可根據(jù)用量配置藥物，并將藥物分裝保存，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致藥物失效。溶解后的TMZ，4℃保存1周，-20℃保存1個月，-80℃保存6個月。

2）凍存液的配制

90%優(yōu)質(zhì)胎牛血清+10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3）完全培養(yǎng)基的配制（推薦使用YJ-h244-001b）

細(xì)胞培養(yǎng)條件

氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%； 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%~80%。

細(xì)胞處理

1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4~6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻，1000rpm/min離心3~5min，棄去上清液。加入1mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，均勻鋪于含6~8mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中，置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，2~3day換液。

注意：①細(xì)胞復(fù)蘇過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細(xì)胞完全貼壁，形態(tài)完全展開，生長狀態(tài)穩(wěn)定后，方可根據(jù)實驗需要添加TMZ藥物。若加藥后細(xì)胞生長狀態(tài)較為緩慢，可適當(dāng)降低TMZ的濃度，或使用不含TMZ的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的TMZ濃度；

②建議復(fù)蘇細(xì)胞時始終穿戴防護手套和面罩，避免凍存管因溫差較大而發(fā)生爆炸，造成人員傷害。

2）細(xì)胞傳代（建議以同等底面積的培養(yǎng)瓶/皿按照1：2比例傳代）

①待細(xì)胞密度達到80%~90%時，即可進行傳代培養(yǎng)。

②棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1次，吸凈殘余的PBS。

③加入適當(dāng)體積的0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶-1mL，其它培養(yǎng)器皿可覆蓋培養(yǎng)底面即可），置于37℃培養(yǎng)箱中消化2~5min，顯微鏡下觀察細(xì)胞細(xì)胞大部分變圓并脫落，即可輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞全部脫落。迅速拿回操作臺，加入2倍體積的、含10%FBS的培養(yǎng)基中止消化。

④將細(xì)胞懸液移入離心管中，1000rpm/min離心5min，棄去上清液。

⑤向細(xì)胞沉淀中加入1~2mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕吹混勻。將細(xì)胞懸液按1：1的比例均勻鋪于2個新的培養(yǎng)瓶/皿中，添加6~8mL完全培養(yǎng)基，置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，2~3day換液。

注意：細(xì)胞傳代過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細(xì)胞完全貼壁，形態(tài)完全展開，生長狀態(tài)穩(wěn)定后，方可根據(jù)實驗需要添加TMZ藥物。若加藥后細(xì)胞生長狀態(tài)較為緩慢，可適當(dāng)降低TMZ的濃度，或使用不含TMZ的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的TMZ濃度。

3）細(xì)胞凍存

①細(xì)胞凍存時，步驟同2）細(xì)胞傳代的①~④，細(xì)胞計數(shù)后，加入配制好的細(xì)胞凍存液，重懸細(xì)胞，按照1×106 ~ 1×107個細(xì)胞/mL分配到一個凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

②將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

細(xì)胞篩選

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染luc的細(xì)胞，隨細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，其luc熒光強度逐漸減弱。若要維持熒光強度，需加入嘌呤霉素進行篩選。

初次進行細(xì)胞篩選時，建議加入終濃度為1ug/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，若無細(xì)胞漂浮或者漂浮較少，即可更換為含2ug/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)篩選，以此類推，至最高藥物濃度為5ug/mL。若篩選過程中，漂浮細(xì)胞大于60%，則停止篩選，換成正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，至細(xì)胞密度約80%，可繼續(xù)加入同濃度嘌呤霉素進行篩選。當(dāng)加入5ug/mL嘌呤霉素時細(xì)胞正常增殖，可停止篩選，用不含藥完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。

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