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產(chǎn)品目錄
兔腫瘤組織巨噬細(xì)胞分離液KIT說(shuō)明書(shū)
更新時(shí)間:2015-12-15 點(diǎn)擊量:816

 

兔腫瘤組織巨噬細(xì)胞分離液KIT說(shuō)明書(shū)實(shí)驗(yàn)方法

 

【產(chǎn)品規(guī)格】

 

2×200ml/Kit

 

【產(chǎn)品組成】

 

為方便廣大用戶使用,試劑內(nèi)容如下:

 

 

 

 

 

名稱

 

產(chǎn)品編號(hào)

規(guī)格

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

A

試劑 A

 

 

 

200ml

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

B

試劑 C

 

 

 

200ml

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

C

樣本稀釋液(贈(zèng)品)

 

2010C1119

200ml

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

D

清洗液(贈(zèng)品)

 

2010X1118

200ml

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

E

F 液(贈(zèng)品)

 

F2013TBD

200ml

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

F

說(shuō)明書(shū)

 

 

 

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】

 

 

 

 

 

A 適用儀器

 

 

 

 

 

 

zui大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)

 

 

 

 

B 耗材

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

產(chǎn)品名稱

 

產(chǎn)品貨號(hào)

 

產(chǎn)地

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

15ml 離心管散裝

 

339650

 

美國(guó) NUNC

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

15ml 離心管架裝

 

339651

 

美國(guó) NUNC

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

50ml 離心管散裝

 

339652

 

美國(guó) NUNC

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

50ml 離心管架裝

 

339653

 

美國(guó) NUNC

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

無(wú)菌膠頭滴管或塑料滴管

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

【檢驗(yàn)方法】

 

 

 

 

 

 

全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2的條件下進(jìn)行。

 

  1. 首先制備組織單細(xì)胞懸液,制備方法詳見(jiàn)“組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)”。

 

  1. 取一支 15ml 離心管,先加入 3ml 試劑 A 后加入 2ml 試劑 C,制成梯度界面。

 

  1. 用吸管小心吸取組織單細(xì)胞懸液加于分離液液面上,400-550g,離心 20-30min。(注: 根據(jù)組織單細(xì)胞懸液量確定離心條件,組織單細(xì)胞懸液量越大,離心力越大,離心時(shí)間 越長(zhǎng),具體離心條件需客戶自行摸索,以達(dá)到分離效果)。

 

 

  1. 離心后,此時(shí)離心管中將出現(xiàn)兩層環(huán)狀乳白色細(xì)胞層。

 

  1. 用吸管小心吸取上層環(huán)狀乳白色目的細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中,向離心管中加入 10ml 清洗液(產(chǎn)品編號(hào):2010X1118),混勻細(xì)胞。

 

  1. 250g,離心 10min。

 

  1. 棄上清。

 

  1. 用吸管以 5ml 清洗液(產(chǎn)品編號(hào):2010X1118)重懸所得細(xì)胞。

 

  1. 250g,離心 10min。

 

  1. 重復(fù) 78、9,棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

 

  1. 差異貼壁法純化細(xì)胞 (1)用巨噬細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號(hào):CTBD2015MAC)或巨噬細(xì)胞*培養(yǎng)基 (產(chǎn)品編號(hào):HCTBD2015MAC)以 1.5-3×106 個(gè)/ml 的密度重懸細(xì)胞,將細(xì)胞鋪于一次 性細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中,放于 37二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。

 

22-4 小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體(俗稱為單核細(xì)胞)。 (310-24 小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。 (4)不貼壁的為淋巴細(xì)胞。

 

注:

 

  1. 無(wú)血清培養(yǎng)基中不含任何動(dòng)物成分,為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或 2-8% 經(jīng)篩選的胎牛血清。

 

  1. *培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清(血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定)。

 

  1. 由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開(kāi)已達(dá)簡(jiǎn)單的純化目的,此法成

 

本相對(duì)較低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽(yáng)性或陰

 

性分選。

 

【注意事項(xiàng)】

 

  1. 全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2的條件下進(jìn)行。為獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,zui 好在取樣 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),樣品存放時(shí)間越長(zhǎng),細(xì)胞分離效果越差。樣品放置超過(guò) 6h 后 分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。

 

  1. 本實(shí)驗(yàn)不要使用高聚合材質(zhì)(如聚苯乙烯)的塑料制品,應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離 心管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品,因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面 會(huì)變成毛面,影響細(xì)胞分離效果。

 

  1. 吸取過(guò)多的乳白色細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的

 

 

 

粒細(xì)胞數(shù)量增加。

 

  1. 分離液用量大于組織單細(xì)胞懸液樣本時(shí),分離效果更佳。

 

  1. 如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過(guò)低,請(qǐng)以尋求幫助,具體詳 見(jiàn)下方生產(chǎn)企業(yè)信息。

 

【儲(chǔ)存條件及有效期】

 

18-25保存,有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌,需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作,啟

 

封后置常溫保存。如 4保存,本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶,影響分離效果。

 

【參考值(參考范圍)】

 

本實(shí)驗(yàn)巨噬細(xì)胞提取率大于 80%

 

下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例,用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。

 

 

紅細(xì)胞

 

白細(xì)胞

 

血小板

 

 

 

 

 

 

 

 

4.0-10.0)×109

 

含量(個(gè)/L

4.0-5.5)×1012

中性粒細(xì)胞

淋巴細(xì)胞

單核細(xì)胞

1.0-3.0)×1011

 

 

50%-70%

20%-40%

3%-8%

 

 

 

 

 

 

 

 

【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】

 

  1. 組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)。

 

  1. 所獲得巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。

 

  1. 所獲得巨噬細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。

 

  1. 所獲得巨噬細(xì)胞的鑒定方法 A.流式細(xì)胞技術(shù) B.免疫組化技術(shù) C.原位雜交技術(shù)

 

D.PCR 技術(shù)

 

注:上述技術(shù)方案詳情請(qǐng)登陸本搜索細(xì)胞分離、

 

純化、擴(kuò)增、鑒定及生物治療技術(shù)手冊(cè),并在說(shuō)明書(shū)項(xiàng)目欄下下載使用。

 

【可能存在的問(wèn)題及解決方法】

 

1.    由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示:

 

出現(xiàn)情況

出現(xiàn)原因

 

建議解決方案

 

 

 

 

 

離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層

轉(zhuǎn)速過(guò)小或離心時(shí)間過(guò)短

適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速

 

 

 

 

 

離心后目的細(xì)胞存在于分離液中

轉(zhuǎn)速過(guò)大或離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

離心后白環(huán)層彌散

細(xì)胞密度過(guò)大

調(diào)整細(xì)胞密度

 

 

 

 

離心后白環(huán)層太淺或看不見(jiàn)

細(xì)胞密度過(guò)小

 

 

 

 

 

 

 

  1. 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心,其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地 區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí),恒定離 心時(shí)間,對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。

 

  1. 本分離液依照標(biāo)準(zhǔn),全部使用藥用級(jí)原料,性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同,可 能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況,可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。

 

注:在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí),離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù),直至達(dá)到分離效果,

 

離心力zui小不得小于 400g,zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。

滬公網(wǎng)安備 31011802001677號(hào)

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